ПЦР с обратной транскрипцией

В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК).^[1]

Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription) в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени (англ. Real-time PCR, Q-PCR), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR.^[2]

Описание метода Править

Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу:

1. Реакция первой цепочки:
Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C.
2. Реакция второй цепочки:
После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.^[2]

Применение Править

ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК.

Примером являются РНК-вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.

Также ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов^[3].

См. также Править

Примечания Править

↑ Hunt M. (2006) Real time PCR tutorial - Copyright 2006, The Board of Trustees of the University of South Carolina (неопр.). Дата обращения: 20 октября 2009. Архивировано 4 октября 2009 года.
↑ ¹ ² Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.
↑ Bustin S. A. Journal of Molecular Endocrinology, 25 // Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays (англ.). — 2000. — P. 169—193.

Литература Править

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

[Hunt_M._(2006)_Real_time_PCR_tutorial-1] Hunt M. (2006) Real time PCR tutorial - Copyright 2006, The Board of Trustees of the University of South Carolina (неопр.). Дата обращения: 20 октября 2009. Архивировано 4 октября 2009 года.

[ReferenceA-2] ¹ ² Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

[3] Bustin S. A. Journal of Molecular Endocrinology, 25 // Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays (англ.). — 2000. — P. 169—193.

[1]

[2]

[3]