НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа

НАДФ-малик энзим
НАДФ-малик энзим
Идентификаторы
Шифр КФ	1.1.1.40
Номер CAS	9028-47-1
Базы ферментов
IntEnz	IntEnz view
BRENDA	BRENDA entry
ExPASy	NiceZyme view
MetaCyc	metabolic pathway
KEGG	KEGG entry
PRIAM	profile
PDB structures	RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum
Gene Ontology	AmiGO • EGO
Поиск
PMC	статьи
PubMed	статьи
NCBI	NCBI proteins
CAS	9028-47-1

НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа или НАДФ-малик-энзим (НАДФ-МЭ) представляет собой фермент, катализирующий химическую реакцию в присутствии двухвалентных ионов металлов:

(S)-малат + НАДФ⁺ -> пируват + CO₂ + НАДФН

В качестве субстрата фермент использует (S)-малат и НАДФ⁺, при реакции образуются пируват, углекислый газ и НАДФН. В ходе реакции малат окисляется до пирувата и CO₂, а НАДФ⁺ восстанавливается до НАДФН.

Фермент принадлежит к семейству оксидоредуктаз, а точнее, к ферментам, взаимодействующим с СН-OH группой донора, а в качестве акцептора использующих НАД⁺ или НАДФ⁺. Систематическое название этого фермента: (S)-малат: НАДФ⁺оксидоредуктаза (оксалоацетат-декарбоксилаза). Малатдегидрогеназа участвует в метаболизме пирувата и связывании углерода. НАДФ-малик энзим является одним из трех ферментов декарбоксилирования, участвующих в концентрировании неорганического углерода у С₄ и CAM-растений. Также к этому классу относятся НАД-малик-энзим и ФЕП-карбоксикиназа.^[1]^[2] Хотя часто одна из трех фотосинтетических декарбоксилаз преобладает, также может встречаться одновременное включение активности всех трех ферментов^[3].

Структура ферментаПравить

Кристаллическая структура гомолога - человеческого малик-энзима; выделенные остатки участвуют в связывании субстрата и катализе. Сайт II содержит GLGDLG мотив, сайт V содержит другой мотив - GXGXXG, выделенный остаток аргинина взаимодействует с НАДФ⁺ и малатом, а обозначенный лизин, возможно, составляет основу катализа. Идентификатор PDB файла для изображения — 2aw5.

На основе кристаллографических данных гомологичного НАДФ-зависимого малик-энзима млекопитающих, была разработана 3D модель НАДФ-МЭ участвующего в C₄ пути в растениях для выявления основных остатков, обеспечивающих связывание субстрата при катализе. Участок связывания НАДФ⁺ включает в себя два богатых глицином мотива — GXGXXG, гидрофобный желобок с участием минимум шести аминокислотных остатков и отрицательно заряженный остаток на конце ß-нити.^[4]^[5] Первичная последовательность первого мотива, ²⁴⁰GLGDLG²⁴⁵, является консенсусным маркером для связывания фосфата, что подтверждает участие НАДФ⁺ в связывании, другие глицин-богатые мотивы принимают классическую укладку Россмана — также являющуюся типичным маркером для связывания НАДФ кофактора.^[6]

Полученные путем искусственного мутагенеза растения кукурузу с дефицитом функции НАДФ-МЭ подтвердждают предложенную молекулярно-биологическую модель. Замена валина глицином в любом месте мотива приводит к полной инактивации фермента. При этом спектральный анализ не показывает существенных отличий от формы дикого типа. Данные свидетельствуют о нарушениях в главном остатке, участвующем в связывании и катализе, а не во междоменном остатке, влияющем на конформационную стабильность. Важную роль играет остаток аргинина в положении 237, взаимодействуя с малатом и НАДФ⁺, он участвует в формировании электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной карбоксильной группой кислоты и фосфатной группой нуклеотида. Не известно, играет ли данный остаток важную роль в субстрат-связывающих взаимодействиях или же определяет положение субстрата при катализе.^[7] Предполагается, что остаток лизина в положении 255 выступает в качестве каталитического основания. Однако, необходимы дальнейшие исследования для точного установления его биохимической роли.

Биологическая функцияПравить

Если рассматривать этот класс ферментов в общем, то малик-энзимы найдены у многих эукариотических организмов (от грибов до млекопитающих). Показана локализация ферментов на субклеточном уровне. Малик энзим присутствует в цитозоле, митохондриях и хлоропластах. В частности, у С₄ растений НАДФ-МЭ локализован в хлоропластах клеток-обкладок проводящего пучка.

В ходе C₄ фотосинтеза — биохимического пути, возникшего для концентрирования CO₂ в месте его фиксации РуБисКО — углекислый газ попадает в клетки мезофилла и образует оксалоацетат. Затем, происходит восстановление оксалоацетата до малата. Малат транспортируется в клетки обкладки, где подвергается декарбоксилированию при участии НАДФ-МЭ. Поскольку в одну клетку обкладки поступает малат от нескольких клеток мезофилла, то в результате происходит концентрирование углекислого газа в месте его фиксации РуБисКо.^[8]

Роль НАДФ-MЭ в коцентрировании углекислого газа подтверждается исследованием, проведенным на трансгенных растениях. Трансгенные растения с частичной потерей функции НАДФ-MЭ (40% активности НАДФ-ME от активности у дикого типа) наблюдалось значительное снижение уровня фиксации CO₂ даже при высоком межклеточном содержании углекислого газа. Это говорит о важном значении НАДФ-MЭ в регуляции потока углерода, направленного к циклу Кальвина.

Регуляция активности ферментаПравить

Было показано, что экспрессия НАДФ-МЭ регулируется факторами абиотического стресса. Для CAM растений в условиях засухи характерно закрывание устьиц для избегания потери воды в результате испарения, которое приводит к голоданию по СО₂. Этот процесс компенсируется за счёт того, что закрытие устьиц активирует трансляцию НАДФ-MЭ, что в свою очередь, во время коротких периодов поглощения СО₂, увеличивает эффективность усвоения СО2,позволяя таким образом осуществлять фиксацию углерода.

В дополнение к длительному регулированию фермента посредством изменения экспрессии генов, существует кратковременное регулирование, которое может осуществляться за счёт аллостерических механизмов. Было показано, что для частичного ингибирования С₄ НАДФ-МЭ субстратом, малат предположительно должен иметь два независимых сайта связывания: один в активном центре, а второй — аллостерический. Однако, ингибирующий эффект зависит от рН и проявляется лишь при рН = 7, но не 8. Наблюдение за изменением активности фермента в зависимости от изменения рН согласуются с гипотезой о том, что НАДФ-МЭ активен во время фотосинтеза: световые реакции приводят к повышению основности в строме хлоропласта — места локализации НАДФ-МЭ, что приводит к уменьшению ингибирующего влияния малата на НАДФ-МЭ, способствуя тем самым увеличению реакционной способности фермента. И наоборот, замедление световых реакций приводит к повышению кислотности среды в строме, вызывая ингибирование НАДФ-МЭ малатом. Необходимость регуляторного механизма объясняется тем, что для реакций цикла Кальвина требуются высокоэнергетические продукты световой фазы, НАДФН и АТФ, и,соответственно, процесс накопления СО₂ без этих продуктов не является полезным.

Для этого белка можно использовать морфеиновую модель аллостерической регуляции.

ЭволюцияПравить

НАДФ-малик энзим, как и все остальные С₄ декарбоксилазы, не развился de novo с целью оказания помощи в фиксации СО₂ РуБисКо. Наиболее вероятно, что НАДФ-МЭ был трансформирован из C₃ вида в процессе фотосинтеза, но возможно также и более раннее происхождение из древнего цитозольного предка. В цитозоле, фермент существовал как ряд изоформ "домашнего хозяйства", предназначенных для выполнения различных функций, включая поддержание уровня малата во время гипоксии, удаление микроспор и защиту от патогенов. Относительно механизма эволюции, считается, что С₄ функциональность была вызвана ошибкой внутри промоторных областей при дупликации гена, что привело к его гиперэкспрессии в кодирующей области в клетках обкладки, порождая неофункционализацию. Выбор в пользу сохранения функции фиксирования CО₂, а также повышенной утилизации воды и азота при стрессовых условиях был обусловлен эволюционным давлением.

Установлено, что в ходе эволюции фермент приобрел несколько ключевых функциональных особенностей, в частности: увеличенную каталитическую активность, тетрамерную структуру и способность к pH-зависимому ингибированию собсвтенным субстратом — малатом ^[9]. Сайт-специфический мутагенез, вместе с разрешеним кристаллической структуры C₄-НАДФ-МЭ из сорго и кукурузы позволил установить ряд аминоксилотных остатков, обеспечивающих эти функции:

Q503, L544 и E339 увеличивают эффективность катализа;
E339 обеспечивает pH-зависимое ингибирование малатом;
F140 обеспечивает поддержание олигомерной структуры;
N-конец участвует в тетрамеризации ^[9].

ПримечанияПравить

↑ Kanai, Ryuzi; Edwards, Gerald E. The Biochemistry of C₄ Photosynthesis // C₄ Plant Biology (неопр.) / Rowan F. Sage, Russell K. Monson. — Academic Press, 1999. — С. 49—87. — ISBN 978-0-08-052839-7.
↑ Christopher J.T., Holtum J. Patterns of Carbon Partitioning in Leaves of Crassulacean Acid Metabolism Species during Deacidification (англ.) // Plant Physiology : journal. — American Society of Plant Biologists, 1996. — September (vol. 112, no. 1). — P. 393—399. — doi:10.1104/pp.112.1.393. — PMID 12226397. — PMC 157961.
↑ Furumoto T., Hata S., Izui K. cDNA cloning and characterization of maize phosphoenolpyruvate carboxykinase, a bundle sheath cell-specific enzyme (англ.) // Plant Molecular Biology : journal. — 1999. — October (vol. 41, no. 3). — P. 301—311. — doi:10.1023/A:1006317120460. — PMID 10598098.
↑ Rossman, Michael G.; Liljas, Anders; Brändén, Carl-Ivar; Banaszak, Leonard J. Evolutionary and Structural Relationships among Dehydrogenases // The Enzymes (неопр.) / Boyer, Paul D.. — 1975. — Т. 11. — С. 61—102. — ISBN 978-0-12-122711-1. — doi:10.1016/S1874-6047(08)60210-3.
↑ Bellamacina C.R. The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins (англ.) // The FASEB Journal (англ.) (рус. : journal. — Federation of American Societies for Experimental Biology (англ.) (рус., 1996. — September (vol. 10, no. 11). — P. 1257—1269. — PMID 8836039.
↑ Rothermel B.A., Nelson T. Primary structure of the maize NADP-dependent malic enzyme (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : journal. — 1989. — November (vol. 264, no. 33). — P. 19587—19592. — PMID 2584183.
↑ Coleman, David E.; Rao, G. S. Jagannatha; Goldsmith, E. J.; Cook, Paul F.; Harris, Ben G. Crystal Structure of the Malic Enzyme from Ascaris suum Complexed with Nicotinamide Adenine Dinucleotide at 2.3 Å Resolution (англ.) // Biochemistry : journal. — 2002. — June (vol. 41, no. 22). — P. 6928—6938. — doi:10.1021/bi0255120. — PMID 12033925.
↑ Edwards G.E., Franceschi V.R., Voznesenskaya E.V. Single-cell C(4) photosynthesis versus the dual-cell (Kranz) paradigm (англ.) // Annual Review of Plant Biology : journal. — 2004. — Vol. 55. — P. 173—196. — doi:10.1146/annurev.arplant.55.031903.141725. — PMID 15377218.
↑ ¹ ² Veronica G. Maurino, Martin J. Lercher, Maria F. Drincovich, Luitgard Nagel-Steger, Alejandro Buschiazzo. Molecular adaptations of NADP-malic enzyme for its function in C 4 photosynthesis in grasses (англ.) // Nature Plants. — 2019-06-24. — P. 1. — ISSN 2055-0278. — doi:10.1038/s41477-019-0451-7. Архивировано 20 июня 2022 года.

[Sage99-1] Kanai, Ryuzi; Edwards, Gerald E. The Biochemistry of C₄ Photosynthesis // C₄ Plant Biology (неопр.) / Rowan F. Sage, Russell K. Monson. — Academic Press, 1999. — С. 49—87. — ISBN 978-0-08-052839-7.

[Christopher96-2] Christopher J.T., Holtum J. Patterns of Carbon Partitioning in Leaves of Crassulacean Acid Metabolism Species during Deacidification (англ.) // Plant Physiology : journal. — American Society of Plant Biologists, 1996. — September (vol. 112, no. 1). — P. 393—399. — doi:10.1104/pp.112.1.393. — PMID 12226397. — PMC 157961.

[Furumoto_T,_Hata_S,_Izui_K_301–11-3] Furumoto T., Hata S., Izui K. cDNA cloning and characterization of maize phosphoenolpyruvate carboxykinase, a bundle sheath cell-specific enzyme (англ.) // Plant Molecular Biology : journal. — 1999. — October (vol. 41, no. 3). — P. 301—311. — doi:10.1023/A:1006317120460. — PMID 10598098.

[4] Rossman, Michael G.; Liljas, Anders; Brändén, Carl-Ivar; Banaszak, Leonard J. Evolutionary and Structural Relationships among Dehydrogenases // The Enzymes (неопр.) / Boyer, Paul D.. — 1975. — Т. 11. — С. 61—102. — ISBN 978-0-12-122711-1. — doi:10.1016/S1874-6047(08)60210-3.

[5] Bellamacina C.R. The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins (англ.) // The FASEB Journal (англ.) (рус. : journal. — Federation of American Societies for Experimental Biology (англ.) (рус., 1996. — September (vol. 10, no. 11). — P. 1257—1269. — PMID 8836039.

[6] Rothermel B.A., Nelson T. Primary structure of the maize NADP-dependent malic enzyme (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : journal. — 1989. — November (vol. 264, no. 33). — P. 19587—19592. — PMID 2584183.

[7] Coleman, David E.; Rao, G. S. Jagannatha; Goldsmith, E. J.; Cook, Paul F.; Harris, Ben G. Crystal Structure of the Malic Enzyme from Ascaris suum Complexed with Nicotinamide Adenine Dinucleotide at 2.3 Å Resolution (англ.) // Biochemistry : journal. — 2002. — June (vol. 41, no. 22). — P. 6928—6938. — doi:10.1021/bi0255120. — PMID 12033925.

[8] Edwards G.E., Franceschi V.R., Voznesenskaya E.V. Single-cell C(4) photosynthesis versus the dual-cell (Kranz) paradigm (англ.) // Annual Review of Plant Biology : journal. — 2004. — Vol. 55. — P. 173—196. — doi:10.1146/annurev.arplant.55.031903.141725. — PMID 15377218.

[:0-9] ¹ ² Veronica G. Maurino, Martin J. Lercher, Maria F. Drincovich, Luitgard Nagel-Steger, Alejandro Buschiazzo. Molecular adaptations of NADP-malic enzyme for its function in C 4 photosynthesis in grasses (англ.) // Nature Plants. — 2019-06-24. — P. 1. — ISSN 2055-0278. — doi:10.1038/s41477-019-0451-7. Архивировано 20 июня 2022 года.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]