Безлигазное клонирование

Безлигазное клонирование (англ. LIC, Ligation Independent Cloning), в генетической инженерии — метод получения плазмид, при котором не используются реакции рестрикции и лигирования.

Технология безлигазного клонирования позволяет сократить время создания новых генетических конструкций, например, для экспрессии рекомбинантного белка и наилучшим образом подходит для высокопроизводительной линии производства белков. Для безлигазного клонирования необходимо подготовить LIC-вектор — линеаризованную последовательность ДНК со специфичными липкими концами длиной 11-14 нуклеотидов. Для этого векторную молекулу гидролизуют рестриктазой по одному сайту, затем обрабатывают ДНК-полимеразой фага Т4 в присутствии одного из нуклеотидов. 3'-экзонуклеазная активность этого фермента приводит к удалению нуклеотидов с 3'-конца до тех пор, пока в последовательности не встретится имеющийся в реакционной смеси нуклеотид (см. рисунок). Векторная молекула специально подготовлена таким образом, что по обе стороны от сайта рестрикции на протяжении 11-14 звеньев данный нуклеотид не встречается. После выделения LIC-вектора его можно хранить и многократно использовать для клонирования в него генов целевых белков. Праймеры для ПЦР этих генов выбираются таким образом, чтобы с одной стороны они были комплементарны началу или концу целевого гена, а с другой — липким участкам LIC-вектора. Тогда после ПЦР получается ген белка, у которого с обеих сторон присутствуют одноцепочечные последовательности длиной 11-14 нуклеотидов, комплементарные векторным. Достаточно смешать такой продукт с вектором и трансформировать смесью компетентные клетки бактерии, чтобы получить плазмиды с геном белка. Таким образом, безлигазное клонирование позволяет избежать нескольких стадий рестрикции, выделения из геля и лигирования, каждая из которых может стать причиной неудачного клонирования.

Схема безлигазного клонирования

ЛитератураПравить

1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high throughput gene cloning and expression / R. de Jong, M. Daniёls, R. Kaptein and G. Folkers // J. Struct. Funct. Genomics. — 2006. — V. 7. — P. 109–118.

2. Lee, J. High-throughput T7 LIC vector for introducing C-terminal poly-histidine tags with variable lengths without extra sequences / J. Lee and S. Kim // Prot. Expr. Purif. — 2009. — V. 63. — P. 58–61.

3. Novy, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Novy, K. Yaeger and K. Kolb // Innovations. — 1997. — V. 5. — P. 1-3.

4. Bardóczy, V. A set of ligation-independent in vitro translation vectors for eukaryotic protein production / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo and T. Mészáros // BMC Biotechnology. — 2008. — V. 8. — № 32. — P. 1-7.